Мясо пептонный бульон сухой. Простые питательные среды мясопептонный агар
** Состав выверен и доведен до соответствия необходимым параметрам
Приготовление:
Размешать 50,0 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды. Прокипятить для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин.
Принцип и оценка результата:
На этой среде обильный рост дают многие бактерии. Ее рекомендуют для получения больших количеств микробной массы в ходе получения вакцины или токсина.
Эта среда по своему составу подобна Среде с мясным экстрактом (АТСС Medium 225). Пептический перевар животной ткани и настой говядины обеспечивают присутствие в среде азота, серы, витаминов и других веществ, необходимых для получения обильного роста микроорганизмов. Натрия хлорид обеспечивает изотоничность среды.
Контроль качества:
Внешний вид порошка:
Гомогенный сыпучий желтый порошок.
Плотность готовой среды:
Образуется среда, соответствующая по плотности 2,5%-ному агаровому гелю.
Цвет и прозрачность готовой среды:
Среда имеет желтую окраску, прозрачна или слегка опалесцирует, если в чашках Петри формируется гель.
Кислотность среды:
При 25°С водный раствор (5,0% вес/об) имеет рН 7,5 ± 0,2.
Культуральные свойства:
Ростовые характеристики референс-штаммов через 18-48 ч при 35°С.
|
Штаммы микроорганизмов (АТСС) |
Рост |
Простые питательные среды Мясо-пептонный бульон (МПБ) является белковой основой всех сред. Готовят на мясной воде с добавлением готового пептона. Пептон – продукт неполного переваривания (гидролиза) белка, используется как источник азота и углерода. Мясо-пептонный агар (МПА) – получают путём добавления к МПБ 1, 5 – 3% a г ap — a г apa. Агар-агар – продукт из морских водорослей, содержит высокомолекулярные полисахариды
Селективные питательные среды стимулируют рост одних микробов и угнетают рост других (за счет добавления в среду определённых компонентов). Так как в этих средах патогенные бактерии размножаются и накапливаются, их называют также средами обогащения. Например, среда Мюллера служит для накопления сальмонелл. К питательной среде добавляют мел, раствор Люголя и гипосульфит натрия. При взаимодействии этих веществ образуется тетратионат натрия, который угнетает рост кишечных палочек, но создает благоприятные условия для размножения сальмонелл.
Дифференциально-диагностич еские среды позволяют отличить один вид микроба от другого на основании разной биохимической активности бактерий. В состав дифференциально-диагностических сред входят: — основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий, — определенный химический субстрат, различное отношение к которому является диагностическим признаком, — индикатор, изменение цвета которого свидетельствует о расщеплении субстрата и образовании конечных продуктов.
Среда Эндо Состав: питательный агар, лактоза, основной фуксин. Среда имеет розовый оттенок. Колонии бактерий, ферментирующих лактозу, окрашиваются в темно-красный цвет; колонии бактерий, не ферментирующих лактозу, остаются бесцветными.
Среда Левина Состав: питательный агар, лактоза, эозин и метиленовый синий. Среда имеет коричневатый оттенок. Колонии бактерий, ферментирующих лактозу, окрашиваются в темно-синий цвет; колонии бактерий, не ферментирующих лактозу, остаются бесцветными.
Среда Плоскирева Состав: питательный агар, лактоза, нейтральный красный, соли желчных кислот, бриллиантовый зелёный. Среда имеет розовато-желтоватый оттенок. Колонии бактерий, ферментирующих лактозу, окрашиваются в бруснично-красный цвет; колонии бактерий, не ферментирующих лактозу, остаются бесцветными.
Техника посевов Метод Дригальского: Каплю исследуемого материала вносят в первую чашку Петри и стерильным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев во второй и третьей чашках. С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и, при посеве на третью чашку, бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды отдельно друг от друга и будут образовываться изолированные колонии. Посев петлёй параллельными штрихами
Посев петлёй параллельными штрихами Колония - это видимое изолированное скопление представителей одного вида микроорганизмов, образующееся при размножении одной бактериальной клетки на плотной питательной среде. Колонии бактерий разных видов отличаются друг от друга по культуральным признакам.
ГОСТ 20730-75
Группа Р35
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
БУЛЬОН МЯСО-ПЕПТОННЫЙ (ДЛЯ ВЕТЕРИНАРНЫХ ЦЕЛЕЙ)
Технические условия
Nutrient media. Meat-pepton broth (for veterinary). Specifications*
______________
* Наименование стандарта. Измененная редакция, Изм. N 1 .
Постановлением Государственного комитета стандартов Совета Министров СССР от 9 апреля 1975 г. N 899 срок действия установлен с 01.01.1976 г. до 01.01.1981 г.*
________________
* Ограничение срока действия снято по протоколу N 4-93 Межгосударственного Совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС N 4, 1994 год). - Примечание изготовителя базы данных.
ПЕРЕИЗДАНИЕ. Август 1975 г.
ВНЕСЕНО Изменение N 1 , утвержденное и введенное в действие с 01.01.90 Постановлением Госстандарта СССР от 28.06.89 N 2194
Изменение N 1 внесено изготовителем базы данных по тексту ИУС N 11, 1989 год
Настоящий стандарт распространяется на мясо-пептонный бульон, представляющий собой питательный раствор, предназначенный для выращивания микроорганизмов.
1. ТЕХНИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ
1. ТЕХНИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ
1.1. Мясопептонный бульон должен изготавливаться в соответствии с действующим технологическим регламентом из мясной воды по ГОСТ 20729-75 с добавлением 1% пептона и 0,5% хлорида натрия в разведениях 1:1, 1:2 и 1:4.
1.2. Мясо-пептонный бульон по физико-химическим, биохимическим и биологическим показателям должен соответствовать требованиям и нормам, указанным в табл.1.
Таблица 1
Наименование показателя | Норма для разведений |
||
Внешний вид | Прозрачная жидкость |
||
Желтый | Светло-желтый |
||
Специфический, свежего мясного экстракта и пептона |
|||
Наличие механической примеси, плесени, хлопьев и осадка | Не допускается |
||
Массовая доля общего азота, %, не менее | |||
Массовая доля азота, аминогрупп, аминокислот и низших пептидов, %, не менее | |||
Массовая доля пептонов, %, не менее | |||
Массовая доля сухого вещества, %, не менее | |||
Массовая доля белка, %, не более | |||
Массовая доля хлористого натрия, % | |||
Концентрация водородных ионов (рН) | |||
Стерильность | Посев на питательные среды не должен давать роста микрофлоры в течение 3 сут в термостате при 37-38 °С |
||
Способность поддерживать рост микробов, оптическая плотность, не менее, для | |||
Staphylococcus aureus "Лоссманов" | Рост типичный |
||
Escherichia coli штамм 675 | |||
Streptococcus faecalis штамм 6783 | |||
1.1, 1.2. (Измененная редакция, Изм. N 1).
2. ПРАВИЛА ПРИЕМКИ
2.1. Мясо-пептонный бульон сдают и принимают сериями.
2.2. Каждая серия мясо-пептонного бульона на предприятиях биологической промышленности Министерства сельского хозяйства СССР должна быть принята государственным контролером Всесоюзного государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов Министерства сельского хозяйства СССР.
2.3. Под серией следует понимать любое количество мясо-пептонного бульона, изготовленное за один технологический цикл, в одной емкости (реакторе) и оформленное одним документом о качестве.
2.4. Для проверки качества препарата от каждой серии мясо-пептонного бульона более 50 л отбирают 2 л, при объеме менее 50 л - 0,6 л.
Если вся серия мясо-пептонного бульона расфасована в бутыли, делают выборку в количестве одной бутыли. Если мясо-пептонный бульон расфасован во флаконы, составляют выборку такого количества флаконов, чтобы объем мясо-пептонного бульона в отобранных флаконах соответствовал указанной выше норме, которая установлена в зависимости от общего объема серии мясо-пептонного бульона.
2.5. При получении неудовлетворительных результатов испытаний хотя бы по одному из показателей серию мясо-пептонного бульона считают не соответствующей требованиям настоящего стандарта.
2.6. Контрольную проверку образцов по требованию потребителя проводит Всесоюзный государственный научно-контрольный институт ветеринарных препаратов Министерства сельского хозяйства СССР.
3. МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЙ
3.1. Методы отбора проб
3.1.1. Пробу мясо-пептонного бульона в количестве 2 или 0,6 л (в зависимости от объема серии препарата) отбирают из реактора или бутыли стерильно.
Пробу объемом 2 л расфасовывают в 10 флаконов по 200 см. Пять флаконов используют для анализа, а пять - оставляют в архиве государственного контролера.
Пробу, отобранную от серии мясо-пептонного бульона объемом менее 50 л, в архиве не оставляют.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
3.2. Внешний вид, цвет, наличие механической примеси, плесени, хлопьев и осадка устанавливают, просматривая флаконы и бутыли с мясо-пептонным бульоном в проходящем свете, для чего флаконы встряхивают, переворачивая вниз пробками, а бутыли покачивают.
3.3. Запах мясо-пептонного бульона определяют в пробе органолептически.
3.4. Определение содержания общего азота
3.4.1. Аппаратура и реактивы
весы аналитические;
колбу Кьельдаля вместимостью 50-100 см по ГОСТ 25336-82 ;
аппарат микро-Кьельдаль;
элемент нагрева (плитку, горелку);
пипетки на 1, 2, 5 см по ГОСТ 20292-74 ;
бюретки по ГОСТ 20292-74 ;
воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72 ;
кислоту серную по ГОСТ 4204-77 , концентрированную и 0,1 н раствор;
натрия гидрат окиси по ГОСТ 4328-77 , 30-33%-ный и 0,1 н растворы, приготовленные на предварительно прокипяченной дистиллированной воде;
перекись водорода по ГОСТ 10929-76 ;
метиловый красный;
метиленовую синь;
спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67 ;
метиловый оранжевый, 0,1%-ный раствор.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
3.4.2. Проведение испытания
Мясо-пептонный бульон в количестве 1 см помещают в колбу Кьельдаля и прибавляют 2 см концентрированной серной кислоты. В горло колбы вставляют стеклянный грушевидный баллончик или небольшую воронку с запаянным кончиком и минерализуют пробу сначала на слабом огне, затем степень нагрева усиливают, не допуская выбрасывания кипящей смеси в узкую часть колбы. Минерализацию проводят в присутствии катализатора - перекиси водорода. Катализатор добавляют после начала кипения по 0,5 см через каждые 15-20 мин до полного обесцвечивания раствора.
После охлаждения содержимое колбы переносят в колбу для отгона, добавляя 10-12 см дистиллированной воды. Полноту переноса проверяют по индикатору метиловому оранжевому. Последняя порция смывных вод должна остаться желтой.
В приемную колбу аппарата Кьельдаля наливают 20 см 0,1 н раствора серной кислоты и 2 капли индикатора Таширо. Индикатор Таширо готовят, растворяя 0,4 г метилового красного и 0,2 г метиленовой сини в 200 см 96%-ного этилового спирта.
Отгонную колбу присоединяют к холодильнику и парообразователю. Содержимое отгонной колбы нейтрализуют 30-33%-ным раствором гидрата окиси натрия по индикатору метиловому оранжевому. Отгон производят до тех пор, пока в приемной колбе соберется около 70 см раствора.
Содержимое приемной колбы титруют 0,1 н раствором гидрата окиси натрия до перехода окраски раствора от лилового к зеленому.
Одновременно ставят контрольный опыт на реактивы, для чего вместо мясо-пептонного бульона в колбу для минерализации берут 1 см дистиллированной воды.
3.4.3. Обработка результатов
Содержание общего азота в мясо-пептонном бульоне () в процентах вычисляют по формуле
где - количество 0,1 н раствора серной кислоты, налитое в приемную колбу, см;
- поправочный коэффициент к титру 0,1 н серной кислоты;
- количество 0,1 н раствора гидрата окиси натрия, израсходованное на титрование испытуемой пробы, или в контрольном опыте, см;
- количество мясо-пептонного бульона, взятое на анализ, см;
0,0014 - количество азота, соответствующее 1 см 0,1 н раствора серной кислоты, г.
За окончательный результат испытания принимают разность между средними арифметическими двух параллельных определений в опытных и контрольных пробах. Допускаемые расхождения между результатами двух параллельных определений не должны превышать ±0,5%.
3.4.2, 3.4.3. (Измененная редакция, Изм. N 1).
3.5. Определение содержания азота аминогрупп аминокислот и низших пептидов
3.5.1. Аппаратура, материалы и реактивы
Для проведения испытания применяют:
рН-метр;
стаканы лабораторные по ГОСТ 25336-82 ;
пипетки, бюретки по ГОСТ 20292-74 ;
формалин технический по ГОСТ 1625-75 ;
натрия гидрат окиси по ГОСТ 4328-77 , 0,1 н раствор;
фенолфталеин, 1%-ный спиртовой раствор;
воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72 .
(Измененная редакция, Изм. N 1).
3.5.2. Подготовка к испытанию
Непосредственно перед проведением анализа готовят формольную смесь. Для этого к 50 см формалина добавляют 1 см 1%-ного раствора фенолфталеина и 0,1 н раствором гидрата окиси натрия доводят смесь до слаборозового цвета.
3.5.3. Проведение испытания
К 2 см мясо-пептонного бульона приливают 18 см дистиллированной воды и доводят 0,1 н раствором гидрата окиси натрия рН смеси до 7,0. Затем приливают 2 см формольной смеси и при постоянном перемешивании потенциометрически титруют 0,1 н раствором гидрата окиси натрия до рН 9,2.
Одновременно ставят контрольный опыт на реактивы, для чего вместо 2 см мясо-пептонного бульона берут 2 см дистиллированной воды.
3.5.4. Обработка результатов
Содержание азота аминогрупп аминокислот и низших пептидов в мясо-пептонном бульоне () в процентах вычисляют по формуле
где - количество 0,1 н раствора гидрата окиси натрия, израсходованное на титрование испытуемой пробы, см;
- количество 0,1 н раствора гидрата окиси натрия, израсходованное на титрование в контрольном опыте, см;
- поправочный коэффициент к титру 0,1 н раствора гидрата окиси натрия;
0,0014 - количество азота, соответствующее 1 см 0,1 н раствора гидрата окиси натрия, г;
2 - количество мясо-пептонного бульона, взятое на анализ, см.
За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Допускаемые расхождения между результатами параллельных определений не должны превышать ±0,2%.
3.5.2-3.5.4. (Измененная редакция, Изм. N 1).
3.6. Определение содержания пептонов
3.6.1. Аппаратура, материалы и реактивы
Для проведения испытания применяют:
фотоэлектроколориметр или спектрофотометр;
пипетки по ГОСТ 20292-74 ;
пробирки по ГОСТ 25336-82 ;
натрия гидрат окиси по ГОСТ 4328-77 , 10%-ный раствор;
медь сернокислую по ГОСТ 4165-78 , 2%-ный раствор;
воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72 ;
центрифуги настольные типа ОПН-8-14,2.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
3.6.2. Подготовка к испытанию
3.6.2.1. При построении градуировочного графика по оси абсцисс откладывают концентрацию истинного пептона в процентах, по оси ординат - оптическую плотность () согласно данным, приведенным в табл.2.
Таблица 2
Концентрация истинного пептона, % | Оптическая плотность, |
3.6.3. Проведение испытания
В пробирку наливают 10 см мясо-пептонного бульона в разведении 1:10, прибавляют по 1 см 10%-ного раствора гидрата окиси натрия и 2%-ного раствора сернокислой меди. Смесь после добавления каждого реактива хорошо встряхивают.
Одновременно проводят контрольный опыт на реактивы, для чего вместо 10 см разведенного мясо-пептонного бульона берут 10 см дистиллированной воды.
Через 2 мин смесь центрифугируют 10 мин с частотой вращения 3000-4000. Интенсивность окраски измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волн 540-560 нм или спектрофотометре при 540 нм в кюветах с рабочей длиной 10 мм.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
3.6.4. Обработка результатов
Концентрацию истинного пептона в мясо-пептонном бульоне определяют по градуировочному графику.
Оптическая плотность () мясо-пептонного бульона равна разности оптических плотностей в опыте с испытуемой пробой и в контрольном опыте. Полученную по графику концентрацию истинного пептона умножают на 10 (т.е. на разведение мясо-пептонного бульона).
За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Допускаемые расхождения между результатами параллельных определений не должны превышать ±5%.
3.7. Определение содержания сухого вещества
3.7.1. Аппаратура
Для проведения испытания применяют:
весы аналитические;
шкаф сушильный лабораторный;
эксикаторы по ГОСТ 25336-82 ;
стаканчики для взвешивания (бюксы) по ГОСТ 25336-82 ;
пипетки по ГОСТ 20292-74 .
(Измененная редакция, Изм. N 1).
3.7.2. Проведение испытания
В предварительно высушенную до постоянной массы бюксу взвешивают с погрешностью не более 0,0002 г мясо-пептонный бульон в количестве 1,0-1,2 г. Затем бюксу с мясо-пептонным бульоном высушивают в сушильном шкафу при температуре 100-105 °С до постоянной массы. Высушивание продолжают до тех пор, пока разность между двумя последующими взвешиваниями будет не более 0,0002 г.
Примечание. Увеличение массы при одном из взвешиваний в процессе высушивания при расчете не учитывают.
3.7.3. Обработка результатов
Содержание сухого вещества в мясо-пептонном бульоне () в процентах вычисляют по формуле
где - масса пустой бюксы с крышкой, г;
- масса бюксы с крышкой и с мясо-пептонным бульоном до высушивания, г;
- масса бюксы с крышкой и с мясо-пептонным бульоном после высушивания, г;
За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Допускаемые расхождения между результатами параллельных определений не должны превышать 0,2%.
3.8. Определение содержания бeлка (по методу Лоури)
3.8.1. Аппаратура и реактивы
Для проведения испытания применяют:
фотоэлектроколориметр;
пробирки стеклянные по ГОСТ 25336-82 ;
пипетки по ГОСТ 20292-74 ;
фильтры бумажные;
натрия гидрат окиси по ГОСТ 4328-77 , 0,1 н. раствор;
натрий углекислый по ГОСТ 84-76 ;
натрий виннокислый или калий виннокислый двузамещенный, 1%-ный раствор;
медь сернокислую по ГОСТ 4165-78 ;
натрий вольфрамовокислый по ГОСТ 18289-78 ;
натрий молибденовокислый по ГОСТ 10931-74 ;
кислоту ортофосфорную 85%-ную;
кислоту соляную по ГОСТ 3118-67 *;
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 3118-77 . - Примечание изготовителя базы данных.
литий сернокислый;
бром по ГОСТ 4109-79 ;
воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72 .
(Измененная редакция, Изм. N 1).
3.8.2. Подготовка к испытанию
Приготовление реактива А
Навеску углекислого натрия массой 2 г, взвешенную с погрешностью не более 0,02 г, растворяют в 100 см 0,1 н. раствора гидрата окиси натрия. Если раствор мутный, то перед определением его надо профильтровать.
Приготовление реактива В
Навеску сернокислой меди массой 0,5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,02 г, растворяют в 100 см 1%-ного раствора двузамещенного виннокислого натрия или калия. Если раствор мутный, то перед определением его надо профильтровать.
Приготовление реактива С
Реактив С готовят непосредственно перед определением путем смешивания 50 частей реактива А и 1 части реактива В.
Приготовление реактива Д
Реактив Д (реактив Фолина) готовят в круглодонной на 1 л колбе из огнеупорного стекла с обратным холодильником.
В колбу помещают 100 г вольфрамовокислого натрия, 25 г молибденовокислого натрия и 700 см дистиллированной воды. После полного растворения солей в колбу добавляют 50 см 85%-ной ортофосфорной кислоты и 100 см концентрированной соляной кислоты. Содержимое колбы осторожно, но хорошо перемешивают. К колбе присоединяют обратный холодильник и смесь кипятят (не слишком сильно) в течение 10 ч. Кипячение можно вести с перерывом, но учитывают лишь период кипения.
После окончания кипячения в смесь добавляют 150 г сернокислого лития, 50 см дистиллированной воды и 5 капель брома (осторожно). Для удаления излишка брома раствор кипятят 15 мин без холодильника под тягой. После охлаждения готовый раствор доводят в мерной колбе до 1 л, фильтруют через бумажный фильтр и хранят в темной склянке с притертой пробкой в темном месте. Реактив Д должен быть соломенно-желтого цвета без зеленого оттенка, затем в реактиве определяют концентрацию кислоты. Для этого приготовленный реактив разводят дистиллированной водой 1:10 (1 см реактива и 9 см воды) и титруют 0,1 н раствором гидрата окиси натрия по фенолфталеину (3-4 капли). Кислотность рассчитывают делением количества миллилитров 0,1 н. щелочи, израсходованного на титрование 1 см реактива Д, на 10. Реактив Д имеет кислотность 1,6-2,3 Н.
Приготовление реактива Е
Реактив Е является реактивом Д, разведенным до 1 н. раствора. Например, если реактив Д является 2,3 н раствором кислоты, то для приготовления 1 н раствора Е надо брать 10 см реактива Д и 13 см дистиллированной воды.
Построение градуировочного графика для определения белка
Готовят ряд растворов с определенным содержанием белка нисходящей концентрации от 0,10 до 0,01%, с которыми ставят цветную реакцию по п.3.8.3. Для приготовления растворов можно использовать альбумин, миозин, нативную сыворотку. Содержание белка в растворах определяют по Кьельдалю. Интенсивность окраски измеряют на фотоэлектроколориметре против воды. Из оптической плотности растворов белка вычитают оптическую плотность контроля на реактивы и полученную величину откладывают по оси ординат. По оси абсцисс откладывают концентрацию белка в растворе (в процентах или в миллиграммах).
Разведение исследуемого образца для постановки цветной реакции выбирают такое, чтобы основное количество замеров по величине оптической плотности лежало в пределах 0,2-0,8, где точность измерения наиболее высокая.
3.8.3. Проведение испытания
В пробирку наливают 1 см разведенного 1:10 мясо-пептонного бульона, добавляют 5 см реактива С, перемешивают и через 10 мин добавляют 0,5 см реактива Е. Одновременно ставят контроль на реактивы, для чего вместо мясо-пептонного бульона берут 1 см дистиллированной воды и добавляют те же реактивы, что и в пробирку с мясо-пептонным бульоном. Смесь хорошо перемешивают и ставят в темное место на 30-40 мин.
Интенсивность окраски измеряют на фотоэлектроколориметре с красным фильтром (630-640 нм) против воды в 5-миллиметровых кюветах. Из величин оптической плотности испытуемого образца вычитают величину оптической плотности контроля на реактивы. По полученным значениям оптической плотности растворов с помощью градуировочного графика определяют содержание белка в пробах. При расчете содержания белка в пробе учитывают кратность разведения перед постановкой цветной реакции.
За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Допускаемые расхождения между результатами параллельных определений не должны превышать ±0,05%.
3.8.2, 3.8.3. (Измененная редакция, Изм. N 1).
3.9. Определение содержания хлорида натрия
3.9.1. Аппаратура, материалы и реактивы
Для проведения испытания применяют:
весы аналитические;
элемент нагрева (горелку, плитку);
пипетки по ГОСТ 20292-74 ;
бюретки по ГОСТ 20292-74 ;
стаканы лабораторные по ГОСТ 25336-82 ;
квасцы железоаммонийные по ГОСТ 4205-77 , насыщенный раствор;
калий роданистый по ГОСТ 4139-75 или аммоний роданистый, 0,1 н раствор;
кислоту азотную по ГОСТ 4461-77 , концентрированную;
серебро азотнокислое по ГОСТ 1277-75 , 0,1 н раствор;
воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72 .
(Измененная редакция, Изм. N 1).
3.9.2. Проведение испытания
2 см мясопептонного бульона помещают в стакан, добавляют 20 см воды, 1 см концентрированной азотной кислоты и 10 см 0,1 н. раствора азотнокислого серебра.
Полученную смесь нагревают до начала кипения и быстро охлаждают путем погружения стакана в сосуд с водой комнатной температуры. После охлаждения к смеси добавляют 2 см насыщенного раствора железоаммонийных квасцов и титруют 0,1 н раствором роданистого калия (или роданистого аммония) до появления желтовато-розового окрашивания.
3.9.3. Обработка результатов
Содержание хлорида натрия в мясо-пептонном бульоне () в процентах вычисляют по формуле
где - количество 0,1 н раствора азотнокислого серебра, взятое в стакан с пробой, см;
- поправочный коэффициент к титру 0,1 н раствора азотнокислого серебра;
- количество 0,1 н раствора роданистого калия (или роданистого аммония), израсходованное на титрование испытуемой пробы, см;
- поправочный коэффициент к титру 0,1 н раствора роданистого калия (или роданистого аммония);
0,005844 - количество хлорида натрия, соответствующее 1 см 0,1 н раствора азотнокислого серебра;
- количество мясо-пептонного бульона, взятое на анализ, см.
За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Допускаемые расхождения между результатами параллельных определений не должны превышать ±0,01%.
3.9.2, 3.9.3. (Измененная редакция, Изм. N 1).
3.10. Определение концентрации водородных ионов (рН)
3.10.1. Аппаратура и материалы
Для проведения испытания применяют:
рН-метр;
стаканы лабораторные по ГОСТ 25336-82 ;
воронки стеклянные;
фильтры бумажные.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
3.10.2. Проведение испытания
Мясо-пептонный бульон фильтруют через бумажный фильтр и в прозрачном фильтрате определяют рН по инструкции, приложенной к рН-метру.
3.11. Определение стерильности
3.11.1. Аппаратура, материалы, реактивы
Для проведения испытания применяют:
термостат с температурой нагрева 37-38 °С;
фильтры бумажные; в пробирки, закрывают ватно-марлевыми пробками и пергаментными колпачками и стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при 1,5 кгс/см.
3.11.3. Проведение испытания
Мясо-пептонный бульон (всю серию) в реакторе или в бутылях выдерживают в течение трех дней при комнатной температуре. Взятую стерильно пробу мясо-пептонного бульона расфасовывают по 100 см в четыре флакона вместимостью 200 см. Затем высевают мясо-пептонный бульон в пробирки с МПБ, МПА и МППБ. Посевы производят в 6-8 пробирок с каждой средой. Посев производят добавлением в каждую пробирку по 0,2 см испытываемого мясо-пептонного бульона. Пробирки и флаконы выдерживают в течение трех дней в термостате при температуре 37-38 °С. Среды в пробирках и мясо-пептонный бульон во флаконах должны оставаться стерильными.
3.11.2, 3.11.3. (Измененная редакция, Изм. N 1).
3.11.4. Обработка результатов
При наличии роста микрофлоры в реакторе или бутылях серия мясо-пептонного бульона бракуется. При наличии роста микрофлоры во всех флаконах и пробирках серия мясо-пептонного бульона также бракуется.
При наличии роста микрофлоры в одном флаконе или в одной-двух пробирках контроль на стерильность повторяют на удвоенном количестве флаконов и пробирок. При повторном росте микрофлоры серию мясо-пептонного бульона бракуют.
3.12. Определение способности поддерживать рост микробов
3.12.1. Аппаратура, материалы и реактивы
Для проведения испытания применяют:
весы технические;
термостат;
автоклав;
рН-метр;
пипетки по ГОСТ 20292-74 ;
бюретки по
3.12.2. Подготовка к испытанию
Готовят согласно действующей рецептуре на основе испытуемого мясо-пептонного бульона мясо-пептонный агар, добавляя к бульону 2% микробиологического агара, и устанавливают рН среды 7,4.
Испытуемый мясо-пептонный бульон и приготовленный мясо-пептонный агар разливают по 8-10 см в пробирки, закрывают ватномарлевыми пробками и пергаментными колпачками и стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при 1,5 кгс/см.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
3.12.3. Проведение испытания
Стерильный мясо-пептонный бульон и мясо-пептонный агар засевают суточными культурами: Staphylococcus aureus "Лассманов", Esherichia coli, штамм 675, Streptococcus faccalis, штамм 6783, полученными из Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских препаратов им. Л.А.Тарасевича. Посев каждой культуры производят пастеровской петлей в три пробирки с МПБ и в три пробирки с МПА. Инкубацию проводят в течение 24 ч в термостате при 37-38 °С.
Рост культуры должен быть типичным и обильным.
3.12.4. Обработка результатов
Типичность роста суточных культур определяют визуально и под микроскопом.
Интенсивность роста на МПА оценивают визуально, в МПБ - визуально и на фотоэлектроколориметре при длине волны 620-640 нм в кюветах с рабочей длиной 5 мм.
4. УПАКОВКА, МАРКИРОВКА, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ
______________
* Наименование раздела. Измененная редакция, Изм. N 1 .
4.1. Мясо-пептонный бульон стерильно расфасовывают в стеклянные бутыли (баллоны) вместимостью 10±0,5 и 20±1 л. Допускается более мелкая расфасовка - флаконы вместимостью 200 и 500 см.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
4.2. Бутыли закрывают стерильными резиновыми пробками, которые сверху завязывают пергаментной бумагой. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
4.3. На бутыли и флаконы наклеивают бумажные этикетки с указанием:
наименования препарата;
количества препарата, л;
номера серии препарата;
даты изготовления;
срока годности;
условий хранения;
обозначения настоящего стандарта.
4.4. Мясо-пептонный бульон хранят в реакторе или в бутылях в чистом, сухом и темном помещении при температуре 4-10 °C.
4.5. Мясо-пептонный бульон транспортируют всеми видами транспорта при соблюдении условий хранения, указанных в п.4.4. Допускается транспортирование при более высокой температуре, но не выше 18 °С, при этом срок транспортирования должен быть не более пяти суток.
.
ГОСТ 10394-72 введен взамен ГОСТ 10394-63 .
ГОСТ 10515-75 введен взамен ГОСТ 10515-63 .
ГОСТ 10931-74 введен взамен ГОСТ 10931-64 .
Электронный текст документа
подготовлен АО "Кодекс" и сверен по:
официальное издание
М.: Издательство стандартов, 1976
К 100 мл мясного бульона добавляют 1 % пептона Пептон- это продукт ферментативного гидролиза белков. Добавляют пептон в среду для увеличения ее питательности, для уплотнения среды в нее добавляют от 2 до 4 % агар-агара
Питательная среда д.б. слабокислой по отношению к цитоплазме микроорганизмов, которые будут выращиваться в ней. Для этого в среду добавляют 0,5% поваренной соли. Реакция среды от 7,0 до 7,4. После введения агар-агара смесь прогревают до неполного студнеобразования.
Приготовление мясо-пептонного желатина.
Эта среда готовится аналогично МПА, но для уплотнения ее применяют на агар-агар, желатин в количестве 10-12% . МПЖ имеет ряд преимуществ перед МПА. Он Лучше соединяется со стеклом, гнилостные бактерии образуют при росте на этой среде весьма характерные колонии, кроме того, некоторые из гнилостных бактерий обладают способностью разжижать желатин, что очень важно для определения вида бактерий. Но МПЖ" плавится при температуре 30-37 0 С, в этом его недостаток.
Дня изучения биохимических признаков микроорганизмов пользуются дифференциально-фагностическими средами. Примером таких сред могут служить среды Гисса. Их применяют для изучения способности м.о. ферментировать углеводы.
В состав сред Гисса входит 1% какого-либо углевода, 1% агар-агара и индикатор. Примером такой среды является и среда Эндо, применяемая для выделения Bact. coli. В состав этой среды входит, кроме МПА, насыщенный спиртовой раствор фуксина, 1% лактозы Na 2 SO 3 , рН 7-7,2 Bact. coli дает на среде Эндо колонии с металлическим блеском. Для изучения плесневых грибов используют среду Сабуро, следующего состава: 1% глюкозы, 1% пептона, 2% агар-агара рН 5-5.6.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ:
Приготовить 100 мл МПА:
1. В кастрюлю напивают воду и ставят на горелку - готовят водяную баню.
2. В колбу наливают 100 мл МБ. Взвешивают 2 г. пептона. 0,5 г. агар-агара. Все это помещают в колбу с мясным бульоном.
3. Колбу ставят в кастрюлю с горячей водой и содержимое колбы подогревают до тех пор пока полностью не расплавится агар-агар и среда не станет однородной. Затем добавляют соды (до слабощелочной реакции по лакмусу).
4. Расплавленную среду разливают в пробирки по 10 мл.
5. Готовят ватные пробирки, обтягивают их марлей и закрывают пробки с приготовленной питательной средой.
6. Пробирки с МПА помещают в корзины. Сдают лаборанту для стерилизации.
Классификация питательных сред
По составу питательную среду подразделяют на 2 группы: натуральные среды неопределенного состава и синтетические среды.
Натуральными обычно называют среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения, имеющих сложный неопределенный хим. состав. Основой таких сред являются различные части зеленых растений, животные ткани. солод, дрожжи, фрукты, овощи... Большинство из них используется в виде экстрактов или настоев. Однако среды с неопределенным составом малопригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов, поскольку они не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды, а с другой стороны выявить, какие вещества образуются по ходу развития м.о. Это связано с тем, что состав натуральных питательных сред очень сложен, кроме того он не является постоянным. Натуральные среды неопределенного состава используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей. К числу сред неопределенного состава относят и так называемые среды «полусинтетические». В их состав наряду с известными хим. соединениями входят вещества неопределенного состава Такие среды находят широкое применение в пром. микробиологии для получения аминокислот, витаминов и антибиотиков. В качестве примера таких сред можно назвать: мясопептонная среда, в состав которой одновременно с мясным экстрактом и пептоном входит поваренная соль, фосфорнокислый каши, иногда глюкоза или сахароза, картофельные среды с глюкозой или пептоном.
Синтетические среды - это такие среды в состав которых входят только определенные, химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Синтетические среды могут иметь относительно большой набор компонентов, но могут быть довольно простыми по составу. Синтетические среды наиболее удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов. Зная точный состав и количество входящих в среду компонентов, можно изучить их потребление и превращение в соответствующие продукты обмена
По назначению: различают элективные и дифференциально-диагностические среды
Элективные среды обеспечивают развитие преимущественно одного вида м.о. или группы родственных микроорганизмов (менее пригодны или совсем не пригодны для развития других). Такие среды применяют главным образом для выделения.
Микроорганизмов из мест их естественного обитания, для получения накопительных культур.
Дифференциально-диагностические среды : это такие среды, которые позволяют по возможности очень быстро отличить (дифференцировать) одни виды м.о. от других. Их состав подбирается с таким расчётом, чтобы он позволил чётко выявить наиболее характерные свойства данного вида м.о. Нередко это достигается введением в среды специальных красителей-индикаторов.
По физическому состоянию среды разделяют на жидкие, плотные и сыпучие. Для выяснения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, а также для накопления их биомассы или продуктов обмена наиболее удобно применять жидкие среды. Плотные среды используют для выделения чистых культур. В промышленной биологии применяют так называемые сыпучие среды. К ним относятся разваренное пшено, пропитанное питательным раствором.
Вопросы для самоконтроля:
2. Как классифицируют их по агрегатному состоянию?
3. Как делятся питательные среды по назначению? В каких случаях удобнее применять те или иные среды?
4. Какие среды называют дифференциально-диагностическими?
5. Как готовят питательные среды? Какие студнеобразователи чаще всего применяют?
6. Что входит в состав МПА? Как его готовят?
7. Чем отличается МПА от МПЖ?
Домашнее задание:
1. Оформление отчета по лабораторному занятию.
2. Подготовиться к защите лабораторного занятия.
Лабораторная работа № 5
Мясо-пептонный бульон (МПБ). Для приготовления мясо-пептонных сред используют мясной бульон, который получают следующим образом: 500 г мелко изрубленного свежего мяса без костей, жира и сухожилий заливают в эмалированной кастрюле 1 л водопроводной воды, нагретой до 50°С, и оставляют настаиваться 12 ч при комнатной температуре или 1 ч при 50-55°С. Мясо отжимают, экстракт процеживают через марлю со слоем ваты, кипятят 30 мин для свертывания коллоидных белков и фильтруют дважды (первый раз через марлю с ватой, второй - через бумажный фильтр). Фильтрат доливают водой до 1 л, разливают в колбы, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120°С 20 мин (пробки колб закрывают сверху колпачками из бумаги). Ватные пробки должны быть плотными, так как они служат фильтром, препятствующим проникновению бактерий из воздуха после стерилизации.
Мясной бульон может быть использован в любое время для приготовления соответствующих сред. Если их готовят сразу, то предварительная стерилизация мясного бульона не требуется.
Нередко в лабораторных условиях мясной настой кипятят вместе с мясом, затем мясо отжимают. При этом бульон получается хорошего качества. При потребности в мясном бульоне особо высокой питательности во время настаивания мяса с водой добавляют немного пепсина и подкисляют бульон соляной кислотой. Пепсин способствует дополнительной гидролизации белковых соединений мяса, и в результате количество доступных бактериям питательных веществ возрастает. Мясо можно заменить мясным экстрактом (5 г на 1 л среды).
Для приготовления МПБ к 1 л мясного бульона добавляют 5-10 г пептона (первый продукт гидролиза белка) для повышения калорийности среды и 5 г поваренной соли для создания осмотической активности. Среду нагревают до растворения пептона, постоянно помешивая.
Затем устанавливают нейтральную или слабощелочную реакцию среды, приливая 20%-ный раствор Na 2 CO 3 до посинения влажной красной лакмусовой бумажки. Дли проверки рН среды удобно использовать индикатор бромтимолблау: 1-2 капли его смешивают в фарфоровой чашке с каплей бульона. В нейтральной среде бромтимолблау - бутылочно-зеленый, в кислой - желтый, в щелочной - синий.
После установления рН среду снова кипятят 5-10 мин, и белки, свернувшиеся при изменении реакции среды, отфильтровывают через бумажный фильтр без осветления бульона или осветлив его белком. Для этого свежий яичный белок взбивают с двойным по объему количеством воды и смешивают с охлажденным до 50 °С бульоном. Смесь кипятят, помешивая, на слабом огне 10 мин, затем фильтруют. Прозрачный мясо-пептонный бульон разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120 °С 20 мин.
Мясо-пептонный агар (МПА). К 1 л МПБ добавляют 15- 20 г агара. Среду нагревают до растворения агара (температура его плавления - 100 °С, затвердевания - 40 °С), устанавливают слабощелочную реакцию среды 20%-ным раствором Na 2 CO 3 и через воронку разливают в пробирки (приблизительно по 10 мл агара столбиком для последующего разлива по чашкам Петри и по 5 мл для получения скошенного агара - косяков).
При разливе агара необходимо следить за тем, чтобы края пробирок оставались сухими, иначе пробки прилипнут к стеклу. Пробирки со средой стерилизуют в автоклаве при 120 °С 20 мин.
Мясо-пептонная желатина (МПЖ). В 1 л МПБ помешают 100-150 г желатины. Температура плавления желатины зависит от ее содержания в среде: в случае 10%-ной концентрации в среде она плавится при 24 °С; в случае 15%-ной - при 25 °С. В летнее время среды готовят, добавляя 15% желатины.
После растворения желатины при осторожном нагревании устанавливают слабощелочную реакцию среды (как для МПБ и МПА), кипятят 5 мин, затем охлаждают до 40-50 °С. Взбитый, с небольшим количеством воды яичный белок вливают в охлажденную желатиновую среду, хорошо взбалтывают и снова нагревают. Среда после выпадения белков в осадок становится прозрачной. Ее фильтруют в горячем виде через бумажный фильтр, разливают в пробирки и стерилизуют в кипятильнике Коха текучим паром, прогревая среду 3 раза по 30 мин каждые 24 ч.
Картофельный агар. Нарезают ломтиками 200 г очищенного и промытого водой картофеля, заливают 1 л водопроводной воды, варят 30 мин. Отвар фильтруют через вату и добавляют воду до первоначального объема. К полученной жидкости прибавляют 2% агара, кипятят до его расплавления и устанавливают нейтральную реакцию среды (рН = 7). Среду стерилизуют 20 мин при 1 атм 1 .
Пивное сусло и сусло-агар. Зерна ячменя замачивают в холодной воде и проращивают при 35 °С. После того как ростки станут вдвое длиннее зерен, последние высушивают до воздушно-сухого состояния (можно при слабом подогревании), получая солод. Для приготовления сусла солод крупно размалывают и смешивают с водой (250 г солода на 1 л воды). Для лучшего выделения фермента амилазы смесь подогревают при 57 °С до исчезновения реакции на крахмал (синего окрашивания с иодом). Пробы на осахаривание крахмала проводят в фарфоровой чашке в капле жидкости.
Сусло процеживают через вату, затем фильтруют через бумажный фильтр. Такое сусло содержит 10-20% сахара. Точное его содержание определяют по плотности раствора при помощи сахариметра. Сусло разбавляют водой до концентрации сахара 6-8% и стерилизуют 30 мин при 115 °С и давлении 0,5 атм. Готовое сусло можно получить на пивоваренном заводе.
Для приготовления сусло-агара к пивному суслу добавляют 2,5-3% агара, кипятят до расплавления, фильтруют через вату и стерилизуют при тех же условиях, как и пивное сусло.
Обезжиренное молоко. Для приготовления питательных сред используют снятое молоко, так называемый обрат, так как жир в молоке неблагоприятно влияет на рост некоторых микроорганизмов. Обрат получают сепарированием молока, нагретого до 34 °С. Можно удалять жир и при отстаивании молока.
При стерилизации следует помнить о том, что молоко нельзя длительное время выдерживать в автоклаве, так как лактоза (молочный сахар), содержащаяся в молоке, может карамелизоваться.
Обезжиренное молоко разливают в стерильные пробирки и выдерживают при 115 °С (давление 0,5 атм) 10 мин. Перед стерилизацией кислотность обрата не должна превышать 22° Тернера, иначе молоко свернется. После стерилизации его выдерживают 3 сут в термостате при 30°С. чтобы спровоцировать развитие спорообразующих и других стойких к нагреванию форм. Через 3 сут пробирки с молоком просматривают и те, в которых развились микроорганизмы, выбраковывают.
При стерилизации в автоклаве иногда возможно побурение молока вследствие карамелизации молочного сахара и пептонизании казеина. При длительной стерилизации на дно пробирки выпадает осадок казеина, который может частично пептонизироваться. Перегретoe побуревшее молоко в качестве среды использовать нельзя.
Дрожжевые среды. Дрожжевая вода. 50-100 г сухих дрожжей разводят в 1 л воды, кипятят 10 мин, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют текучим паром по 30 мин в течение 3 дней ежедневно.
Дрожжевой автолизат. 200 г прессованных дрожжей разводят в 1 л воды; добавляют 2 г Na 2 HPO 4 , каплями I н. раствор NaOH (до рH 6,1) и 5 мл хлороформа, выдерживают при 37 °С 2 сут, доводят раствором NaOH до рН 7,4, кипятят 30 мин. фильтруют через бумажный фильтр, разливают в посуду и стерилизуют при 115 °С 30 мин.
Дрожжевой экстракт. 1 кг прессованных дрожжей разводят в 1 л воды, смесь кипятят 1 ч, трижды отфильтровывают через бумажный фильтр и стерилизуют при 115 °С 30 мин.
Бобовый отвар. 50 г фасоли (лучше белой) заливают 1 л водопроводной воды и варят до готовности так, чтобы бобы не разварились. Полученный отвар фильтруют через вату, добавляют к нему 10 г сахара и доводят до первоначального объема. Устанавливают слабощелочную реакцию среды, разливают в колбы и стерилизуют в автоклаве 30 мин при давлении пара 1,5 атм.
1 По системе СИ давление принято выражать в паскалях (Па): 1 атм = 1,01325 х 10 5 Па = 0,1 МПа.
